澳门新葡萄京官网注册如何选择合适的定量PCR仪

发布时间:17-05-09 17:26分类:技术文章 标签:PCR仪,PCR仪不同分类的对比
常见的PCR仪有四种类型,分别是普通基础PCR仪,梯度PCR仪,实时荧光定量PCR仪和原位PCR仪。这四种PCR仪的一般原理有相似的地方,但在结构和配件方面还存在一些差异。那么它们有哪些异同点呢?PCR仪不同分类的对比(1)普通基础PCR仪由主机,加热模块,PCR管样品基座,热盖,控制软件组成。(2)梯度PCR仪除具有普通PCR仪的结构外,还具有特殊的梯度模块,可实现对梯度温度和梯度时间等参数的调整。因此可以在一次实验中对不同样品设置不同的退火温度和退火时间,从而可在短时间内对PCR实验条件进行优化,提高PCR科研效率。(3)实时荧光定量PCR仪在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。(4)原位PCR仪与普通PCR仪相比,用玻片代替了PCR管,其反应过程是在载玻片的平面上进行的。

核心提示:定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。从生物通前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键――由于定量PCR仪主要由两部分组成,一个是PCR系统,一个是荧光检测系统。从生物通前面的原理介绍不难看出选择定量PCR仪的关键――由于定量PCR必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的,对于定量PCR系统来说,重要的参数除了传统PCR的温控精确性、升降温速度等等,更重要的还在于样品孔之间的均一性,以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统,多色多通道检测是当今的主流趋势――仪器的激发通道越多,仪器适用的荧光素种类越多,仪器适用范围就越宽;多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光,仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品,通道越多,仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管
LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR仪需要考虑的另外一个因素是软件设计,这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。――随着定量PCR技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用,市面上不同品牌和设计的定量PCR仪也不断推陈出新,生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR仪,各有各精彩。

发布时间:17-05-11 17:49分类:技术文章 标签:PCR仪,PCR仪有哪些类型?
根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR,实时荧光定量PCR仪等几类。1、普通PCR仪一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的,对目的基因退火温度的扩增。主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。2、梯度PCR仪一次性PCR扩增可以设臵一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其*适合的退火温度不同,通过设臵一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增*澳门新葡萄京官网注册,可以筛选出表达量高的*适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样既节约时间,也节约经费。在不设臵梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度,是每一排管都有精确的加热控温探头,2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。梯度PCR仪多应用于科研、教学机构。3、原位PCR仪(有些品牌的PCR仪具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能,通过替换模块进行多用途开展实验工作)是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位臵或目的基因在细胞内的作用位臵等。可保持细胞或组织的完整性,使PCR反应体系渗透到组织和细胞中,在细胞的靶DNA所在的位臵进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA,还能标出靶序列在细胞内的位臵。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。4、实时荧光定量PCR仪(fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQPCR)在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号激发和采集系统和计算机分析处理系统,形成了具有荧光定量PCR功能的仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同,在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统,得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR仪有单通道,双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道;有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,实现一次检测多种目的基因的功能。实时荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。实时荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

1.
传统的96孔板式定量PCR仪传统的96孔板式定量PCR仪以美国应用生物系统公司为代表。传统96孔板式定量PCR仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材,可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应,但是缺点也显而易见――温度均一性不佳――平板固定加热模块的PCR温度控制有边缘效应――样品槽上每个孔之间的温度存在差异――也就是所谓位置效应(可参考生物通龙虎榜:PCR仪的选择一文),因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致,样本和样本之间的温度控制也可能存在差异,对于灵敏度极高的定量PCR来说,任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大,不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大,温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢,因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR仪的荧光检测分析系统,由于96孔板上样品孔的位置是固定的,每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同,有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行,试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ和Bio-Red公司的定量PCR仪也属于这一类。

ABI的7500型荧光定量PCR仪激发光源为卤钨灯光源,5色滤光镜,可同时激发96个样品,超低温CCD具备同时多点多色检测的能力,能够有效地分辨FAM/SYBR
Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas
Red,和Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量,可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer
Express非常有用,“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR所需的TaqMan探针”。各型号都有实时动态和终点读板两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA或RNA拷贝数。可以动态显示PCR扩增曲线的生成,定量的线性范围大于9个数量级,区分5000和
10000个拷贝的DNA模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性分析等。当然,也可以作为普通
PCR仪使用。ABI定量PCR仪最大的优势在于ABI已经发布十二万种Taqman Gene
Expression Assays
人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒,覆盖人类全部4万个基因,二百万种Taqman
Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP
检测试剂盒,为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI
的定量PCR仪均支持两种定量化学:TaqMan荧光探针和SYBR Green
I荧光染料。其熔解曲线功能用于判断PCR扩增反应是否特异,有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜,新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高,带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块,使得高通量处理数据的能力大大增强,应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。

MJ的Option系列是在MJ原来的常规PCR仪基础上改造,采用LED光源PMT光电倍增管荧光检测器。
96个单色LED光源对应96孔板,但是单色LED激发波长范围较窄。Option是单道单个光电倍增管荧光检测器,升级的Option2是双PMT光电倍增管荧光检测器,PMT灵敏度高但一次只能扫描一个样品,所以Option系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT可同时进行双色检测
。优势之一是带梯度功能。Bio-Rad也算是个熟悉的品牌,iCycler
iQ实时定量PCR系统也是96孔平板式固定加热的,荧光检测波长范围400-700nm,可4波长同时检测,仪器的设计灵活,定性和定量部分可独立工作,同样可完成梯度PCR。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。专利技术intensifier荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ被
Bio-Rad收购后,Option和iCycler
iQ目前还是各自走各自的销售渠道,至于将来Bio-Rad会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。2.创新概念的离心式实时定量pcr仪为了克服平板式定量pcr温度均一性差的缺点,聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr仪,以roche罗氏的lightcycle和corbett的rotor-gene为代表。pcr扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样,借助空气加热和转子在腔内旋转,转子上每个孔都是“等位”的,几乎无差别,很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题――
corbett的rotor-gene样品间温度差异小于±0.01℃,最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触,接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小,但事实上roche的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr仪,可以达到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以达到5℃/秒,优于多数的平板式PCR仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖;还可以将酶加在管盖上,升温后离心到管底与反应体系混合,实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快,对于常规需要2个多小时完成的定量PCR反应,Roche的LightCycler仅需20―30分钟即可完成,可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用,因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了,或者换句话来说,2个多小时你可以做4―5轮定量实验了。

由于转子上的样品孔是旋转可移动的,因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器,随时检测旋转到跟前的样品管――由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的,使用的是同一个检测器和激发光源,有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长;离心式定量PCR都是逐个检测样品的,所以大多采用了长寿的LED冷光源,运行前无须预热,无须校正;系统检测重复性也更好。

离心式定量PCR仪的缺点主要是离心的转子小,能容纳的样本量有限,由于是离心式转子,常规的96孔板和条形管就不适用,有的还需要特殊的消耗品,增加使用成本。当然离心式定量PCR仪不可能带梯度功能。

Roche的Lightcycler刚推出的时候确实让人眼前一亮!现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点—–快速:利用空气动力学原理,20-30分钟内完成30-40个循环。控温准确:变温速率最高可达20℃/秒,温差≤±0.3°C多波长检测:可同时在530、640及710nm三个通道进行检测,实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。

此外动态检测范围达10个数量级,而无须将样品稀释;具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增,具多种检测模式如Taqman探针、荧光染料SYBR
Green
I检测、序列特异杂交探针等;探针及引物设计方便,杂交探针及引物设计的限制少,而且亦可方便地选用合适大小的扩增子(100-1000bp)。但是
Lightcycler需要使用特定的毛细管作为样品管,这在某种程度上提高了消耗成本,也不方便作为常规PCR仪使用。

Corbett的Rotor-Gene也是离心式的定量PCR仪。在品牌的角度上Corbett当然不如Roche罗氏在国内那样家喻户晓,之所以特别提到这个产品,确实是因为Corbett的设计有独到之处。比如Corbett的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道,4个独立LED激发光源保证最少的光谱交叉
。PMT检测,6个检测滤光片,可检测荧光包括FAM/SYBR Green I,
TET,VIC/JOE,HEX,Max, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas
Red,和Cy5,Cy5.5等等,机器的适用性非常宽,开放的试剂系统使得机器可适用Taqman探针、荧光染料SYBR
Green
I检测、分子信标、FRET探针、Amplifluor探针等等,不像某些牌子的定量PCR仪只能适用Taqman法和荧光染料检测。Rotot-
Gene3000灵敏度高,宽达12个数量级的线性范围,可正确区分1、2、3拷贝的基因,重复性极佳。

由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转,使得样品间的温度均一性极佳,同一热反应室提供完全相同的反应条件,同一光学通路提供完全相同的测量通道,每标本每循环检测32次,满足高精度和一致性要求。Rotot-Gene3000提供了36
x0.2ml和72×0.1ml两种转子,检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的,因而可以使用普通的0.2ml
PCR管,并允许在试管盖上标记,这降低了使用成本。Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler,但优于多数的固定加热模块的机型,能达到5℃/秒。Corbett还有一个光学变性专利――让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序,检测荧光染料信号大小的变化,找到代表全部双链DNA解链的峰值对应温度,在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度,也不需要延长孵育时间。这个专利使得反应过程大大缩短。Rotot-Gene主要的问题也是可容纳的样品数量少,只能靠反应速度快,同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。对于大量样品的实验室,
Corbett同时还提供定量PCR反应自动加样系统,不单可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性,也可以配套
Roche和ABI的定量PCR仪。这样就不用担心加样累坏了。

3.第三类的荧光定量pcr仪以cepher公司的smart%20cyclerii为代表,对于国内的用户来说比较新鲜,但这个一直受美国国防部和安全局、美国军队传染病医学研究中心、美国军队士兵和生物化学合作所资助的公司却相当有来头。smart%
20cyclerii获得过1998年美国研发r&d100金奖。smart%20cyclerii的机型小巧,只有16个样品槽,它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块,也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量pcr仪!独立控温的好处首先是,你可以在同一定量
pcr仪上分别进行不同条件的定量pcr反应,更为灵活自定义的梯度优化反应也好,或者是完全不同的几组反应――甚至,你可能只进行个别样品的检测,只占用其中几个样品槽――过一会儿其它的同事也要用――他不需要等待你的反应结束,而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应!对于各有各忙的多成员的实验室,要是个别样品就占据96孔样品槽,其它人每轮要再等2个多小时,有时还要等几轮,那可够郁闷的。smart%20cycler%20ii的使用频率可以被最大化,大家都不用等待!这个世界上唯一允许不同条件pcr同时进行的定量pcr仪拥有独一无二的优点,是其它任何平板式或者离心式定量pcr都不具备的。

此外,每个温控模块只控制一个样品槽,升降温速度当然更快――高达10℃/秒,控温精度自然就更高――这里根本不用考虑不同样品槽之间的温度均一性的问题,只有每个模块控温精确度的问题。对于普通的96孔板固定加热模块,本身有控温精度和准确度的差异,再加上样品槽不同位置之间的温度差异,而
Smart
CyclerII就完全减少了一个误差因素。优异的特性使得只要20分钟就可以完成常规的定量PCR反应,大大提高研究人员的工作效率。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触,保证荧光激发和检测不受外界干扰,固定的结构使得仪器运行更稳定,使用寿命更长。整合有4通道光学检测系统,分别可以检测FAM/SYBR
Green I, Tet/ Cy3, Texas
Red和Cy5,可在同一样本中进行多靶点分析,同时检测4种荧光信号,可使用多种检测方法,包括Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物和Scorpion引物和荧光内插染料等等。宽达9个数量级的线性范围。

不过Smart
CyclerII需要使用独家的扁平反应管,增加了反应成本,上样也不如传统的方法方便,而且16个样品槽也不大适合批量反应的要求――不过Smart
Cycler II的软件设计允许一台电脑同时操作6台Smart Cycler
II,部分弥补了缺憾。所以Smart Cycler
II会更适合多成员、样本量不大、要求快速出结果的实验室。不是每个实验室都总是要同时检测几十上百个样品吧?

在选购定量PCR前之前我们需要先了解自己的需要――是同时检测大量样本?还是小规模的研究?是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法?随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市,还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。生物通撰写本文的目的并非指出哪一类的仪器更适合我们的需要――毕竟不同应用领域、不同的实验室有着不同的需求,所以了解不同类型的定量PCR仪的特点有助于选择更适合自己需要的仪器,“不求最好,但求适合”。

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

相关文章

网站地图xml地图