分光光度计百科

发布时间:17-03-07 14:13分类:技术文章
标签:分光光度计,分光光度计的构成原理
分光光度计是根据物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当我们在已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液,分光光度计测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区,除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多,且常使用单色光纯度较差的仪器,故测定时应用标准品或对照品同时操作。
产品特点 采用高性能优质光栅,波长精度更高;
采用进口钨灯,发光效率高,使用寿命长,功耗降低;
超大规模集成,T/A转换精度高,稳定性高;
微机系统的应用,使操作使用简单可靠。 仪器构成
分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。
仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。
光谱范围 包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200~400
nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400~760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.
氢灯(或氘灯)的发射光谱:氢灯能发出185~400
nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源. 物质的吸收光谱(1)
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
物质的吸收光谱(2)
当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.
入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光
如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为”空白”去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:
入射光 = 吸收光 十 透过光 原理
分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光线透过测试的样品后,部分光线被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。
单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式:
  A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc   式中 :A 为吸光度;
  I。为入射的单色光强度;   I 为透射的单色光强度;   T
为物质的透射率;   k 为摩尔吸收系数;   L
为被分析物质的光程,即比色皿的边长 c 为物质的浓度
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发布时间:17-04-14 15:07分类:技术文章 标签:分光光度计,分光光度计百科
分光光度定义分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为:(1)200~400nm的紫外光区(2)400~760nm的可见光区,(3)2.5~25μm(按波数计为4000cm~400cm)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度,所有仪器应按照*计量检定规程或本附录规定,定期进行校正检定。原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光线透过测试的样品后,部分光线被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。单色光辐射穿过被测物质溶液时,被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式:A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc式中
:A 为吸光度;基本原理I。为入射的单色光强度;I 为透射的单色光强度;T
为物质的透射率;k 为摩尔吸收系数;L 为被分析物质的光程,即比色皿的边长c
为物质的浓度物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液,测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区,除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多,且常使用单色光纯度较差的仪器,故测定时应用标准品或对照品同时操作。分光光度计组成分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。光谱范围包括波长范围为400~760
nm的可见光区和波长范围为200~400
nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400~760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.氢灯(或氘灯)的发射光谱:氢灯能发出185~400
nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.物质的吸收光谱(1)如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.物质的吸收光谱(2)当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.入射光=
反射光 + 分散光 + 吸收光 +
透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为”空白”去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:入射光
= 吸收光 十
透过光分光光度计特点1、采用高性能优质光栅,波长精度更高;2、采用进口钨灯,发光效率高,使用寿命长,功耗降低;3、超大规模集成,T/A转换精度高,稳定性高;4、微机系统的应用,使操作使用简单可靠。分光光度计技术参数波长范围:320∽1000nm光谱带宽:4nm杂散光:≤0.5%(在360nm处)波长准确度:优于±2nm透射比准确度:≤±1nmT分光光度计操作方法1.接通电源,打开仪器开关,掀开样品室暗箱盖,预热10分钟。2.将灵敏度开关调至“1”档(若零点调节器调不到“0”时,需选用较高档。)3.根据所需波长转动波长选择钮。4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处,用擦镜纸擦清外壁,放入样品室内,使空白管对准光路。5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器,使读数盘指针指向t=0处。6.盖上暗箱盖,调节“100”调节器,使空白管的t=100,指针稳定后逐步拉出样品滑竿,分别读出测定管的光密度值,并记录。7.比色完毕,关上电源,取出比色皿洗净,样品室用软布或软纸擦净。注意事项1.该仪器应放在干燥的房间内,使用时放置在坚固平稳的工作台上,室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风,防止灯泡灯丝发亮不稳定。2.使用本仪器前,使用者应该首*了解本仪器的结构和工作原理,以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前,应该对仪器的安全性能进行检查,电源接线应牢固,通电也要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确,然后再按通电源开关。3.在仪器尚未接通电源时,电表指针必须于“0”刻线上,若不是这种情况,则可以用电表上的校正螺丝进行调节。分光光度计日常维护分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和对主要技术指标的简易测试方法,自己经常对仪器进行维护和测试,以保证仪器工作在*佳状态。一、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀,使金属镜面的光洁度下降,引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀,产生光能不足、杂散光、噪声等,甚至仪器停止工作,从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。应具备四季恒湿的仪器室,配置恒温设备,特别是地处南方地区的实验室。二、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性,也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此必须定期清洁,保障环境和仪器室内卫生条件,防尘。三、仪器使用一定周期后,内部会积累一定量的尘埃,*好由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作,同时将各发热元件的散热器重新紧固,对光学盒的密封窗口进行清洁,必要时对光路进行校准,对机械部分进行清洁和必要的润滑,*后,恢复原状,再进行一些必要的检测、调校与记录。

分光光度法定义与应用1.1定义:分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术.
1.2特点:灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质.
1.3应用:生物<>化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.
2.分光光度计的基本结构和工作原理2.1分光光度计的分类2.2分光光度计工作原理2.3分光光度计的基本结构2.4分光光度法的测量误差

2.5显色反应及其影响因素2.1分光光度计的分类分光光度计的分类红外分光光度计:测定波长范围为大于760
nm的红外光区可见光分光光度计:测定波长范围为400~760
nm的可见光区紫外分光光度计:测定波长范围为200~400
nm的紫外光区2.2分光光度计工作原理人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱,如下图所示.
2.2.1分光光度计的光谱范围包括波长范围为400~760
nm的可见光区和波长范围为200~400
nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.
钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400~760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.
氢灯的发射光谱:氢灯能发出185~400 nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源.

2.2.2物质的吸收光谱(1)
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.
不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.
2.2.2物质的吸收光谱(2)
当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液.
入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为”空白”去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则:
入射光=吸收光十透过光
2.2.3物质吸光度(A)与透射比(T)的关系设I0为经过空白校正后入射光的强度;I为透过光的强度.
根据实验得知I = I0 ?10-εc l
式中,c表示吸收物质的摩尔浓度;l表示吸收物质的光径,用cm表示;ε表示吸收物质的摩尔消光系数,它表示物质对光的吸收特性,不同物质的ε数值不同.所以I
/ I0 = 10-εc l 令T(透射比) = I / I 0 T = 10-εcl
若以T对吸收物质的浓度作图,则得图1-5-2中的曲线. 由上式可得1g(1 / T) =εc l
lg(l / T)为物质的吸光度(A) A = 1g(1 / T) 2.2.4 Lambert -Beer定律( E =εc
l)
上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律–Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律.

2.3分光光度计的基本结构无论哪一类分光光度计都包括:光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表.分光光度计各部件的次序如图所示:
5个基本部件分光光度计的基本部件(1):
光源:分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯.
单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在分光光度计中多用作为色散元件.
吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350
nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池. 分光光度计的基本部件(2):
吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.比色皿上的指纹,油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗.
常用光电池,光电管和光电倍增管三种.
测量装置—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的仪器常附有自动记录器,可自动描出吸收曲线.
检测器棱镜与光栅棱镜:光波通过棱镜时,不同波长的光折射率不同;因而能将不同波长的光分开.玻璃对紫外线的吸收力强,故玻璃棱镜多用于可见光分光光度计.石英棱镜可在整个紫外光区传播光,故在紫外光分光光度计中广为应用.
衍射光栅:在石英或玻璃表面上刻划许多平行线(每英寸约刻15 000—30
000条).由于刻线处不透光,通过光的干涉和衍射使较长的光波偏折角度大,较短的光波偏折角度小,因而形成光谱.
棱镜单色器装置示意图光源照到棱镜(或光栅)以前,先要经过一个入射狭缝,再通过平行光镜使成为平行光束投到棱镜上.透过棱镜的光再经另一聚光镜,在此聚光镜的焦面内可得一清楚的光谱图.如在焦线处放—出射狭缝,转动棱镜使光谱移动,就可以从出射狭缝射出所需要的单色光.整个装置称为”单色器”
检测器—光电池光电池装在一个特制的匣子里面由3层物质组成的圆形或长方形薄片.第一层是一种导电性良好的金属,这是光电池的负极.中间极薄的一层是半导体硒,第3层是铁,这是光电池的正极.当光电池受光照射以后,半导体硒的表面逸出电子,这些电子只向负极方向移动,而不向正极移动,因此在上下两金属片间产生一个电位差,线路连通时即产生电流

检测器—光电管光电管光电管是由封装在真空透明封套里的一个半圆柱型阴极和一个丝阳极组成.阴极的凹画上有一层光电发射材料,此种物质经光照射可发射电子.当在两极间加有电位时,发射出来的电子就流向丝阳极而产生光电流.对于相同的辐射强度,它所产生的电流约为光电池所产生电流的1/4.由于光电管具有很高的电阻,所以产生的电流容易放大.
检测器—光电倍增管
光电倍增管它比普通的光电管优越,它可将第一次发射出的电子数目放大到数百万倍.当电子打在兼性阳极上时,能引起更多的电子自表面射出.这些射出的电子又被第二个兼性阳极所吸引,同样再产生更多的电子.
此过程重复9次后,每个光子可形成106~107个电子.这些电子最后被收集在阳极上.所得到的倍增电流可进一步加以放大和测量.

2.4分光光度法的测量误差分光光度法的测量误差选择适宜波长的入射光控制吸光度A的遍数范围选择适当的参比溶液仪器测量误差测量条
件选择2.4.1仪器测量误差由朗伯-比尔定律可知,只有在一定的浓度范围内,即一定的吸光度范围同内,由分光光度计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的;当透光率接近0或1.0时,其相对误差趋于无限大;一般在百分透光率在10~80%的范围内(即吸光度在1~0.1),浓度测量相对误差较小;对于精密度高的仪器.当吸度A=0.7-0.2时(百分透光率约为20-60%,测量误差约为1%.
2.4.2测量条件选择(1)选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,必须选择溶液最大吸收波长的入射光.
(2)控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7读数范围内时,测量的准确度较高.
(3)选择参比溶液:参比溶液是用来调节仪器工作零点的.若样品溶液,试剂,显色剂无无色可用蒸馏水作参比溶液;反之应采用不加显色剂的样品液作参比溶液.

2.5显色反应及其影响因素显色反应及其影响因素显色反应一般要求影响显色反应因素选择性好灵敏度高生成的有色化合物性质稳定显色剂与有色物颜色反差大显色反应要易于控制显色剂用量反应液的酸碱度(pH)
反应温度显色反应时间干扰离子的影响2.5.1显色反应一般要求(1)选择性好:显色剂最好只与一种被测组分起显色反应;
(2)灵敏度高:灵敏度高有笪微量组分的测定;
(3)有色化合物性质稳定:确保前后测定准确.
(4)显色剂与有色物颜色反差大:两者最大吸收波长之差应大于60nm;
(5)显色反应要易于控制:结果的确保实验再现性.
2.5.2影响显色反应的主要因素(1)显色剂用量:通过实验来确定最适用量;
(2)反应液的酸碱度(pH)溶液酸碱度直接影响金属离子与显色剂存在形式以及有色化合物组成的稳定性.
(3)反应温度:不同的显色反应需要不同的反应温度,一般显色反应可在室温下完成.
(4)显色反应时间:显色反应的速度有快有慢.
(5)干扰离子的影响:应采用适当方法消除其影响.

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