澳门新葡萄京官网首页养鸡场常用的禽流感检测方法简介

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发布时间:17-03-02 13:56分类:技术文章 标签:禽流感,检测禽流感病毒的方法
2013年3月份,“H7N9”在上海和安徽率*发现,随后在江苏,浙江传播蔓延。生物学家已经检测出这种病毒的结构确认其毒株了。北京熙缜隆博环保科技有限公司代理的仪器会成为您的*,欢迎有意购买者拨打公司热线电话010-68940148。一、单链构型多态性(SSCP)作为检测基因变异的手段已得到广泛应用,其原理是单个核苷酸的置换引起DNA单链构象改变,在非变性电泳中足以导致泳动率变化。二、血清学检测2.1病毒中和试验(NT)
作为经典方法,病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料,临床几乎不用。2.2血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验AIV
能够与鸡红细胞发生凝集现象,这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。用抗不同血凝素的抗血清,由血凝抑制试验来确定HA亚型。2.3神经氨酸酶抑制(NI)试验微量神经氨酸酶(NA)抑制剂抑制NA的活性,并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。该方法成本低,适于大规模地应用。2.4琼脂凝胶扩散试验(AGP)
用于检测AIV共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有的AIV
都具有型特异性共同抗原,用一种AIV的抗原或抗血清*可对所有AIV
的抗体或抗原进行鉴定。免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定可以定性,免疫单辐射扩散试验可以定量。2.5免疫荧光技术(IFT)
将抗原或抗体标记上荧光素,再进行抗原抗体反应。*早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞中特异性的抗原、核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗原。用NP抗原的荧光抗体染色,主要出现核内荧光;用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光,核内也可出现部分荧光。2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)
运用ELISA原理建立的AIV检测方法较多,如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法,为进一步研究检测试剂盒提供基础。AIV抗体胶体金检测试纸条则是胶体金免疫层析分析法,用纯化病毒与胶体金颗粒偶联,吸附在玻璃纤维上制作而成,不需要其他试剂,一步完成,反应时间只需要几分钟(5~10min),是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方法。三、病原学检测鸡胚分离培养是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法,可以作为金标准,特异性和敏感度均可以达到*。四、核酸扩增方法4.1RTPCR基于MP、NP
基因的高度保守区的引物,RTPCR可以鉴定AIV。为提高扩增的灵敏度和特异性,也可采用巢式或半巢式RTPCR。4.2多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和经济的检测方法。4.3Realtime
RTPCR(RRTPCR)运用特异性的荧光水解探针的RRTPCR方法可使检测时间缩短为4
h。Lee等建立的检测H5、H7亚型AIV的RRTPCR方法,与传统的培养方法比较,并以EID50(50%鸡胚致病指数)为评价指标,呈正相关(r
= 0972),T 检验无显著差别(P >021)。其重复性试验呈正相关(r =
0902),灵敏度H5为1 fg或 102 RNA拷贝,H7为10-1 fg或10
RNA拷贝,所测病毒浓度均低于1010
EID50,该灵敏度高于培养方法。4.4依赖核酸序列的扩增(NASBA)NASBA是一种快速、等温的RNA
扩增技术,整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase
H)共同协作而完成,不需特殊仪器,不需温度循环,是以转录为基础,单链核苷酸的连续扩增,其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针杂交后,形成复合物,经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度。Collins等检测了亚欧地区H5亚型AIV,同时还鉴别出高致病及低致病H5亚型。Lau
等建立的NASBA技术可以检测H1~H15亚型的AIV,并能区分出H5及H7亚型,整个过程从核酸分离、扩增、检测在6
h 以内,灵敏度与鸡胚培养相当。4.5环介导的等温扩增(loopmediated
isothermal amplification, LAMP)
Poon等介绍了一种新的更加简便的扩增方法,即环介导的等温扩增,特异性地针对6个*立的结合位点设计两对引物扩增,以看家基因或外源性RNA分子作为阳性对照。由于反应中产生大量焦磷酸镁,可以肉眼判断结果,无需凝胶电泳。作者用该方法检测了SARS病毒后,又检测了H1~H3的AIV,与常规方法比较符合率为*。五、基因芯片将RTPCR获得的cDNA固化于芯片,利用核酸探针技术构建的检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台,
Cy3、Cy5标记的核酸探针与靶DNA杂交,可以进一步鉴别混合体系中扩增产物。Li等用cDNA芯片及mRTPCR对流感病毒进行检测及分型,结果显示cDNA芯片为基于PCR的诊断技术提供了补充,因为基于PCR的方法,直接从DNA扩增片段大小不足以证明是目的产物。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测
AIV方法的对照,但病毒分离培养耗时长,至少需7
d,不利于快速诊断,病毒分离的实验条件要求较高,同时有高致病性的危险,对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。AIV在鸡胚培养过程中还可能发生发生变异。血凝及血凝抑制试验特异性好,但其操作相对繁琐,同时必须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检查对*后确诊有回顾性诊断价值,一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。由于
AIV
血清型众多,新的变异株不断出现,制备血清型特异性单克隆抗体相对困难,且在各种免疫接种的情况下,血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术(NAT)检测
AIV,选择好靶基因和引物及优化反应参数,均可获得高灵敏度和特异性。对于血清型众多的
AIV,不同亚型致病性不同,宿主分布不同,故快速、特异地分型在 AIV
诊断中显得尤为重要,而当前的核酸扩增技术尚不能高通量地鉴别出所有 HA 或
NA 的已知亚型。RTPCR 方法能够获得所有 AIV 的已知 HA
亚型,但*终结果尚需借助测序方法,不能作为常规检测手段。要实现高通量、大规模的检测,有望借助生物芯片这项技术。生物芯片正逐步应用于细菌及病毒的检测,它不仅能克服
PCR 扩增技术中难题,对 PCR
扩增技术还能起到补充作用。目前人们针对病毒,甚至 AIV
检测芯片不断优化杂交条件;将核酸扩增产物片段化,以减少核酸二、三级结构效应对杂交的影响;以及对芯片载体结构和检测方法进行改进,都为建立快速、灵敏、特异的
AIV 检测方法提供平台。

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养鸡场常用的禽流感检测方法简介禽流感的检测方法很多.大体有病毒胍分离法、病毒巾和试验、血凝试验和血凝抑制试验、神经氨酸酶抑制试验、琼脂凝胶扩散试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附实验、胶体金免疫层析法、单链构型多态性、反转录聚合酶链式反应、多重反转录聚合酶链式反应、实时反转录聚合酶链式反应、依赖核酸序列扩增、环介导等温聚合酶链式反应、基因芯片等,但限于资金、设备、技术卡¨检测时间等闲素,养鸡场包括种鸡场经常使用的方法是血凝抑制实验测定抗体和胶体金快速诊断试纸检测病毒这两种方法,有条件的养鸡场还使用酶联免疫吸附实验和反转录聚合酶链式反应方法,下面就有关方法及其应用价值予以简单介绍。

猪繁殖与呼吸综合征由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以感染妊娠母猪晚期流产、产死胎、早产、木乃伊胎和弱胎,各种年龄猪呼吸障碍、厌食为特征的高度传染性疾病,在美国最早发生该病。荷兰人Wensvoot等1991年首次于发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时被称为Lelystad病毒。随后很多国家也相继分离到此病毒。郭宝清等首次从国内有相似症状发病猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒,从此代表该病在我国的存在。杨汉春阐述PRRSV有2个血清型,即美洲型(代表毒株为VR-2332株)和欧洲型,欧洲和美洲分离株毒株之间存在明显的抗原差异性。在对我国分离毒株的基因组进行分析表明,目前在我国流行的毒株均属于美洲型,并没有发现和分离到欧洲型毒株。汤德元等分析了美洲型的PRRSV,其可分为4个亚群,我国现今流行的PRRSV毒株属于四个亚群中的3个亚群,即以PRRSV
BJ-4株为代表的属于1亚群;以HB-1/2002、CH-la和HB-2/2002株为代表的属于2亚群;以BJ-13为代表的属于4亚群。本病传播迅速,尤其在养猪技术进步和经济发达国家,由于猪群密集、流转频繁,更易引起流行。目前,各国对本病进行了大量深入的研究。PRRS可危害各种日龄阶段的猪,并且临床表现多样,同时引起细菌病或病毒病等继发感染,导致临床症状的复杂化。因此,仅根据临诊症状及流行病学特点很难做出诊断,此病的诊断必须借助于实验室诊断技术。本文主要对近年来实验室对猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的进展进行综述,以期为猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供一定的理论支持和参考。1
病毒的分离鉴定

1日趋边缘化的抗体检测

病毒的分离鉴定是目前病毒病最真实的一种诊断方法。常用于PRRSV分离的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞、非洲绿猴肾细胞(MA-104、CL-2621、Marc-145等),以及克隆自Marc-145的更敏感的HS.2H细胞。但分离PRRSV欧洲株只能用PAM细胞。该病毒的分离可来源于血清、肺脏、肺泡灌出物、脾脏、淋巴结和扁桃体,尤其以血清和肺脏组织分离成功率最高;较易从急性感染病例猪中分离到PRRSV;据有关报道PRRSV在死胎和新生仔猪中分布情况不一致,流产在死胎脾脏和淋巴结巨噬细胞分布含量比较多,而新生仔猪则常见于肺脏。采集后的样品应冷藏或冷冻运输和保存,将采集的样品经过处理后接种于长满的单层PAMs细胞后1~4
d即可出现细胞病变,细胞最初呈现灶状变圆、膨大,随后皱缩,脱落形成拉网空洞。当接种于CL-2621细胞时,CPE出现得比较缓慢,需在感染后2~6
d才会侵染细胞单层。PRRSV在接种于Marc-145细胞48
h即可出现典型的CPE变化,具高度敏感性。由于致病力的不同,不同分离株在细胞培养上生长情况各异,甚至有些病毒株并不出现CPE现象,与此同时,必须同时结合间接免疫荧光试验和免疫过氧化物酶单层试验等病原检测方法进行验证。

大部分鸡场应用血凝抑制试验测定抗体效价,其目的:一是检测疫苗防疫后的抗体效价能否达到预定要求,比如成鸡的平均抗体效价是否在28以上:二是看抗体是否出现较大的离散度甚至出现“犬牙状”分布.以此来判定鸡群是否受到野毒感染。但是判断是否野毒感染的前提条件是,疫苗毒与野毒株高度要一致,但在实际生产中,禽流感病毒经常发生变异,依国内近十几年的经验,强毒株禽流感每过年左右就会出现l~2个变异的主流行株.能够突破疫苗抗体.给疫苗防疫水平日常抗体.给疫苗防疫水平日常的养鸡场造成极大的损失.甚至个别祖代种鸡场也难逃毁灭性的打击。所以抗体检测只能检测防疫后疫苗产生了多少疫苗抗体,不能显示这些抗体对野毒株的保护率是多少..有父利用血凝抑制试验进行的血清抗体覆盖试验显示,2010—2011年在多省分离到的十几个毒株.标准疫苗阳性血清的覆盖率仅为3%~25%.

2 血清学诊断方法

这也意味着野毒感染的抗体检测.需要用该野毒的分离毒株来检测,而不能使用标准株.所以,抗体检测法用于禽流感野毒感染的诊断的有效性大幅下降.作为一种方法已渐趋边缘化.而直接测定瘸畿的快速诊断抗原的胶体金试纸法越来越受重视。

血清学试验是一种相对较于传统的PRRSV诊断方法,在病毒抗原和抗体的检测用得比较广泛。血清学实验有其较强的特异性,但在敏感性上有所欠缺。

需要指出的是,重组疫荫是在旧野毒株血凝素基因片段上切去几个“有害”碱基后再通过基冈拯救的方式“嫁接”到人流感株H1Nl上制成,这种方法增加了“安全性”和大幅度提高了疫苗产量、但是其保护率则会双蓖地打一些折扣,效能比肯定要低于野毒株疫笛、有许多养殖朋友经常会问,现在流行的毒株是“Re托几”?实际上,大自然中根本没有这个系列的毒株,它是人造毒株系且其犬部分成分还是H1Nl,与真正的H5Nl毒株相差很多。

2.1 中和试验

2应用渐多的胶体金试纸抗原快速诊断

在对PRRSV抗体进行检测的过程,中和试验对PRRSV的抗体特异性是很好的,但是由于中和抗体出现的时期比较晚,需在感染后4~5周才能首次检测到VN抗体,感染后的10周达到最高,在大部分的临床检测PRRSV新近病例中,与IPMA、IFA、ELISA作比较其敏感都低于它们,所以SN不适用于对PRRSV感染的早期诊断。Yoon等对中和试验进行了改良,其改良内容是加入20%的猪新鲜血清增加补体的量,目的是为了提高检测敏感性,在感染后9~11d即可检出较高滴度的VN抗体。但该方法也对环境、人员的技术要求高,目前也大多局限在实验室做研究用。

普通不分型的禽流感胶体金快速诊断胶体金试纸,是利用胶体金免疫层析原理,用禽流感病毒保守核衣壳蛋白的单克隆抗体来捕捉各亚型禽流感毒株,它不需要任何特殊设备,田间野外也可操作,特异性好,灵敏度高,并能通过金粒子来显色,十几分钟即可出现眼见的检测效果,与早孕试纸的使用方法类似,简单而且实用,价格也较低。南于抗体检测在病毒变异时不能准确反映疫苗对野毒的保护率以及鸡场的生物安全度,所以直接捕捉病毒的胶体金试纸法,在养鸡场中的疾病诊断中日渐普及。

2.2 酶联免疫吸附试验

有许多养殖朋友在确定禽流感病毒后,还要求通过试纸法来对病毒进行分型,国外之前有分型用的禽流感H5、H7、H9亚型的胶体金试纸.但是近几年来,我们国家的禽流感毒株变化较快.血凝素上个别关键抗原位点变异了.所以这些分型用的胶体金试纸只能用于2010年前的毒株.其分型试纸不能检测到2010年后许多的流行毒株,比如当下的禽流感H5N1血凝素遗传进化树上七分支的病毒。有效的试纸有赖于通过新毒株所做的新的单克隆抗体,但普通不分型禽流感胶体金试纸由于使用保守蛋白的单克隆抗体,对这些变异的毒株检测仍然有效。

Albina等将PRRSV接种在PAM细胞上,以制备阳性抗原和模拟抗原,首次建立了检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附试验,许多结果表明ELISA具有与IPMA一样的特异性,并且敏感性更高,如今商品化的间接ELISA诊断试剂已在全球范围内广泛使用。罗长保等将ATCCVR-2332株接种Hs.2H细胞,制备抗原,以血清抗体与模拟抗原反应的d450nm值作为标准,从而建立了用于血清中PRRSV抗体的间接ELISA方法,实验结果显示,有着与IFA相同的特异性,更高敏感性。王刚等用差速离心法提纯抗原,以NC膜做载体,成功地建立了Dot-ELISA,并与IFA具有相同的特异性,敏感性高于IFA。仝利剑等建立抗体双抗原夹心ELISA方法,利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对该方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区多个养猪场的近300份血清,总体的特异性和敏感性都较高。就目前看来,ELISA方法快速灵敏,特异性和敏感度均较高,操作简便,结果能自动显示,对于大批量血清样品的检测也实用。

禽流感抗原胶体金抗原检测方法与检测抗体的采样要求不一样,抗体检测需要一定比例的样本量,以此来表示抗体的分布情况,抗原检测则采样量很少,只要检测到病毒,就意味着养鸡场出现了病毒的感染,而且准确度很高,同时禽流感油乳剂灭活苗,由于是以油包水力‘式制作,缓慢释放到组织中.不能到达试纸采样的呼吸道、肠道和泄殖腔等部位,所以试纸小会测到疫苗中的灭活病毒.灭活茁的使用不影响禽流感试纸对野毒的检测。

2.3 间接荧光抗体试验

在这种情况下,如果需要对病毒进行分型,则需要进行聚合酶链式反应对特定鉴别基闽进行扩增.

间接荧光抗体试验与免疫过氧化物酶单层试验具有一样的特异、敏感性,如今在欧洲和北美的许多国家得到了普遍的使用。在我国也有自己生产的IFA和微量IFA诊断试剂盒供应。可以从感染6d后的猪体内检测到PRRSV抗体,在30~50d时抗体达到峰值,随后逐渐降低,直至4~6个月后抗体消失,但该方法需要进行细胞培养,需用倒置显微镜观察,结果不能自动显示,对所需环境和人员的要求高,不适合大规模监测;并且,IFA与IPMA只能检测出与实验用PRRSV抗原性相近的PRRSV分离株。

3其他检测方法

2.4 免疫过氧化物酶单层试验

有条件的养鸡场如果有酶标仪和聚合酶链式反应仪.就会使用免疫吸附测定方法和PCR法测定禽流感病毒、ELISA方法町以测抗体也可以测病毒,但病毒的分型T作仍会受到与胶体金方法一样缺乏有效新单克隆抗体的限制.其分型工作依然会遇到对当下一些流行毒株无法分型的困难,,另外,由于ELISA方法需要昂贵的没备以及较长的操作时间.而且不具备灵敏度、特异性优势.在禽流感这个项目的检测上,已逐步让位于不需设备、操作时问很短且价格便宜的胶体金免疫层板方法.目的是能够对禽流感进行较好分型的是PCR法,不过它需要根据变异禽流感毒株设计新的引物,从病料的采集、冻融、RNA提取与反转录、基因扩增、琼脂凝胶电泳以及紫外荧光检测特异性条,小时以上。本方法除设备昂贵、检测液成本较高外,对操作人员和操作条件也有很高的技术要求,有条件的鸡场为了达到对禽流感的有效防控,可能会将几种检测方法进行组合使用,比如病料采集后进行胶体金斌纸、EUSA和PCR检测.得到阳性结果后进行病毒的分离、血凝和血凝抑制试验等等.也有的单位会将复制得到的病毒的基图片段进行测序,并绘制病毒基冈的遗传进化图.为下一步的疾病防控作提供关犍指导

免疫过氧化物酶单层试验方法是历史最长的检测PRRSV抗体的方法,在欧洲国家被普遍使用,IPMA具有较高的敏感性和特异性,能在病毒感染6
d后猪体中检出PRRSV抗体,该方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等细胞系上进行完成的,不好的是由于母猪血清和4周龄内的仔猪血清可以与对照的巨噬细胞反应,导致背景着色,从而影响结果的判定,且结果不能自动显示,具一定的主观性;同时还需细胞培养和倒置显微镜观察,费力费时,大规模检测费高,也不利于推广应用。

2.5 乳胶凝集试验

王忠田等利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原,成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测,具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测,结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%,与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87%,检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层检测PRRSV血清抗体的新方法。

2.6 胶体金抗体检测技术

崔尚金等建立猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术,运用胶体金标记纯化后的PRRSV基因工程表达抗原,以一种微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法。特异性交叉试验证明,GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性,与其他方法对比检测证实了其敏感性,生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性。猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测PRRSV抗体提供了一种快速简便的方法。当然,目前国内一些大专院校也建立了更为方便、快速的诊断方法,如乳胶凝集试验和间接血凝试验,但其在敏感性、特异性和试剂的重复性、稳定性上均有待提高。

3 PRRSV的分子生物学诊断

3.1 RT-PCR检测

PRRSV的RT-PCR检测在许多研究及检测诊断实验室已普遍使用,且敏感度达到了pg水平。Suarez等建立了检测PRRSV的RT-PCR方法,该方法敏感性好,并可检出隐性感染。Mar-Dassi等通过设计特异性的上下游通用引物,建立了鉴别诊断北美加拿大株和欧洲株PRRSV的RT-PCR诊断方法,该方法在组织中检测时敏感性高于IFA敏感性。赵耘等建立的检测PRRSV的套式RT-PCR法,其敏感性与RT-PCR法相同,且操作更简单。顾海洋等根据猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病在NSP2基因上有87bp连续缺失,从NCBI上下载7对猪高致病性蓝耳病保守序列设计一对引物。通过RT-PCR方法进行检测证明实验室所保存的这两株毒株分别为猪高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病,并且建立了猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病的检测方法。

3.2 实时荧光定量PCR

在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术可定量PCR。实时荧光定量PCR技术(real
time fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)于1996年由美国Applied
Biosystems公司推出,它的原理是在PCR反应体系中添加合适的荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,随后利用标准曲线对未知目的片段进行定量分析的手段。该方法不仅实现了对DNA模板的定量,并且具有高灵敏度、特异性和可靠性更强、自动化程度高、实时性和准确性等特点,如今已普遍用于分子生物学研究和医学研究等各类领域。

在外国,实时荧光定量PCR技术在动物疫病的临床诊断方面应用也十分广泛。Callahan等建立的real-time
RT-PCR技术可以用于检测猪精液、血清及各类组织中的PRRSV,省时省力且敏感度高于常规RT-PCR。Martinez等优化改良了的PRRSV
SYBR Green
I时RT-PCR检测方法,具有很高的特异性和敏感性,其检出量为101.52TCID50/样品,并通过TM值和溶曲线分析基因型,能够很好地鉴别美洲株和欧洲株PRRSV毒株的基因型。

王宗照等根据Genbank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR
Green
I实时PCR检测HP-PRRSV的方法。结果表明,该方法能够检测到HP-PRRSV的存在,不与其他猪源病毒发生非特异性反应。与常规PCR方法相比,两者的符合率为100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点。王荣等根据Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因序列设计1对特异性保守引物,扩增位置在M基因的14744-14846位,长度为103
bp。提取PRRSV的RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBRGreen
I实时定量PCR检测PRRSV的方法。并用该方法检测送检的临床疑似病料,试验结果表明,本研究建立的PRRSVSYBR
Green I
PCR特异性强,耗时短,操作简单。刘长龙等为快速检测PRRSV,针对其N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并改良检测PRRSV的Taq
MAN荧光定量PCR方法。应用该方法检测除猪繁殖与呼吸综合征病毒以外的猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的测试敏感度可达到10拷贝,比普通PCR灵敏10~100倍,结果表明该实验建立的PRRSV
Taq Man荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

3.3 依赖核酸序列的扩增技术

NASBA即依赖于核酸序列的扩增,是一种扩增RNA的新技术,是由1对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42
℃进行,可在2h左右将模板RNA扩增约109倍,不需特殊的仪器。梁海霞等针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1中编码nsp2的基因序列设计引物,创建了NASBA方法,并联合微孔板中液相杂交与酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳表明,NASBA方法扩增出了特异性核酸阳性条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Northern杂交最高可分别检测到1:50和1:30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/Ml的Hun4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV,预示NASBA在PRRSV检测上应用前景广阔。

3.4 原位杂交技术

Suarez等以PRRSVRNA为模板,通过RT-PCR扩增和地高辛标记,制备了ORF7433bP
cDNA地高辛探针,对试验感染猪的肺脏、淋巴结和肾脏进行了原位杂交,检测到了PRRSVRNA,较免疫组化具有更高的敏感性和特异性。Chueh等通过制备地高辛探针,成功建立了敏感荧光原位杂交技术,该方法采用原位RNA/RNA杂合体与抗地高辛抗体碱性磷酸酶结合,再用坚固红TR盐/萘酚As-MX磷酸盐显色,用显微镜观察,并认为该方法结果明显、清晰,对PRRS临床诊断及病毒持续感染研究有重要意义。

3.5 环介导等温扩增技术

Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(Loop-Mediated
Isothermal
Amplification,LAMP),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。张跃伟等建立了荧光显色在环介导等温扩增检测PRRSV的方法,该方法使用了针对靶序列M+N基因的1组引物,并且能在63
℃等温条件下30
min内完成反应。在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒。结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可快速检测PRRSV。鑫婷等建立了PRRSV
RT-LAMP检测方法,试验结果表明,RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测,其他人Rovira等、Chen等也建立了类似的方法。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。

3.6 基因芯片检测技术

杨林等建立PRRSV基因芯片检测技术,其根据PRRSV的核衣壳蛋白编码基因序列设计了1对特异性引物P1/P2,扩增出大小为294
bp的目的条带;再根据目的片段,设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5′端用荧光素CY3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测,建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测,表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,对PRRSV的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。郭焕成等建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法,设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的nsp2基因片段的二重PCR引物,并设计长度为31~35
bp的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株nsp2基因缺失区域的探针,建立寡核苷酸芯片方法。检测了该方法的特异性和灵敏度,并进行初步应用。结果通过杂交模式可清楚地区分经典毒株与缺失毒株;芯片探针与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒样品无非特异性杂交;芯片法与常规PCR法的灵敏度相近;对12份疑似高致病性PRRS猪样品的结果与普通PCR法一致。

由于当前PRRS给世界各国生猪养殖带来了巨大的经济损失,严重威胁了生猪养殖的发展,采用高效、特异、准确的检测技术对
PRRS进行诊断和控制有着重要的意义。而用于
PRRS检测的技术有多种多样,每一种检测方法均有其自身的优点与不足,现实的生产实践应用中应根据实际检测需要及实验条件等情况来选择相应的检测技术,从而为该病的诊断和防控措施的制订提供一定的依据。本文较详细地综述了目前常用的PRRSV的诊断方法与技术,不同的技术方法从不同方面对猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供了便利工具,大大加快了该病的防控步伐。随着相关研究在不断深入,许多新的诊断技术和方法还会不断涌现,这些都必将为今后的生猪养殖产业的发展带来更好的技术保障。

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