猪繁殖与呼吸综合征诊断技术的研究进展

发布时间:17-03-02 13:56分类:技术文章 标签:禽流感,检测禽流感病毒的方法
2013年3月份,“H7N9”在上海和安徽率*发现,随后在江苏,浙江传播蔓延。生物学家已经检测出这种病毒的结构确认其毒株了。北京熙缜隆博环保科技有限公司代理的仪器会成为您的*澳门新葡萄京官网注册,,欢迎有意购买者拨打公司热线电话010-68940148。一、单链构型多态性(SSCP)作为检测基因变异的手段已得到广泛应用,其原理是单个核苷酸的置换引起DNA单链构象改变,在非变性电泳中足以导致泳动率变化。二、血清学检测2.1病毒中和试验(NT)
作为经典方法,病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料,临床几乎不用。2.2血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验AIV
能够与鸡红细胞发生凝集现象,这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制,即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。用抗不同血凝素的抗血清,由血凝抑制试验来确定HA亚型。2.3神经氨酸酶抑制(NI)试验微量神经氨酸酶(NA)抑制剂抑制NA的活性,并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。该方法成本低,适于大规模地应用。2.4琼脂凝胶扩散试验(AGP)
用于检测AIV共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有的AIV
都具有型特异性共同抗原,用一种AIV的抗原或抗血清*可对所有AIV
的抗体或抗原进行鉴定。免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定可以定性,免疫单辐射扩散试验可以定量。2.5免疫荧光技术(IFT)
将抗原或抗体标记上荧光素,再进行抗原抗体反应。*早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞中特异性的抗原、核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗原。用NP抗原的荧光抗体染色,主要出现核内荧光;用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光,核内也可出现部分荧光。2.7酶联免疫吸附试验(ELISA)
运用ELISA原理建立的AIV检测方法较多,如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法,为进一步研究检测试剂盒提供基础。AIV抗体胶体金检测试纸条则是胶体金免疫层析分析法,用纯化病毒与胶体金颗粒偶联,吸附在玻璃纤维上制作而成,不需要其他试剂,一步完成,反应时间只需要几分钟(5~10min),是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方法。三、病原学检测鸡胚分离培养是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法,可以作为金标准,特异性和敏感度均可以达到*。四、核酸扩增方法4.1RTPCR基于MP、NP
基因的高度保守区的引物,RTPCR可以鉴定AIV。为提高扩增的灵敏度和特异性,也可采用巢式或半巢式RTPCR。4.2多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和经济的检测方法。4.3Realtime
RTPCR(RRTPCR)运用特异性的荧光水解探针的RRTPCR方法可使检测时间缩短为4
h。Lee等建立的检测H5、H7亚型AIV的RRTPCR方法,与传统的培养方法比较,并以EID50(50%鸡胚致病指数)为评价指标,呈正相关(r
= 0972),T 检验无显著差别(P >021)。其重复性试验呈正相关(r =
0902),灵敏度H5为1 fg或 102 RNA拷贝,H7为10-1 fg或10
RNA拷贝,所测病毒浓度均低于1010
EID50,该灵敏度高于培养方法。4.4依赖核酸序列的扩增(NASBA)NASBA是一种快速、等温的RNA
扩增技术,整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase
H)共同协作而完成,不需特殊仪器,不需温度循环,是以转录为基础,单链核苷酸的连续扩增,其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针杂交后,形成复合物,经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度。Collins等检测了亚欧地区H5亚型AIV,同时还鉴别出高致病及低致病H5亚型。Lau
等建立的NASBA技术可以检测H1~H15亚型的AIV,并能区分出H5及H7亚型,整个过程从核酸分离、扩增、检测在6
h 以内,灵敏度与鸡胚培养相当。4.5环介导的等温扩增(loopmediated
isothermal amplification, LAMP)
Poon等介绍了一种新的更加简便的扩增方法,即环介导的等温扩增,特异性地针对6个*立的结合位点设计两对引物扩增,以看家基因或外源性RNA分子作为阳性对照。由于反应中产生大量焦磷酸镁,可以肉眼判断结果,无需凝胶电泳。作者用该方法检测了SARS病毒后,又检测了H1~H3的AIV,与常规方法比较符合率为*。五、基因芯片将RTPCR获得的cDNA固化于芯片,利用核酸探针技术构建的检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台,
Cy3、Cy5标记的核酸探针与靶DNA杂交,可以进一步鉴别混合体系中扩增产物。Li等用cDNA芯片及mRTPCR对流感病毒进行检测及分型,结果显示cDNA芯片为基于PCR的诊断技术提供了补充,因为基于PCR的方法,直接从DNA扩增片段大小不足以证明是目的产物。病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测
AIV方法的对照,但病毒分离培养耗时长,至少需7
d,不利于快速诊断,病毒分离的实验条件要求较高,同时有高致病性的危险,对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。AIV在鸡胚培养过程中还可能发生发生变异。血凝及血凝抑制试验特异性好,但其操作相对繁琐,同时必须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检查对*后确诊有回顾性诊断价值,一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现。由于
AIV
血清型众多,新的变异株不断出现,制备血清型特异性单克隆抗体相对困难,且在各种免疫接种的情况下,血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术(NAT)检测
AIV,选择好靶基因和引物及优化反应参数,均可获得高灵敏度和特异性。对于血清型众多的
AIV,不同亚型致病性不同,宿主分布不同,故快速、特异地分型在 AIV
诊断中显得尤为重要,而当前的核酸扩增技术尚不能高通量地鉴别出所有 HA 或
NA 的已知亚型。RTPCR 方法能够获得所有 AIV 的已知 HA
亚型,但*终结果尚需借助测序方法,不能作为常规检测手段。要实现高通量、大规模的检测,有望借助生物芯片这项技术。生物芯片正逐步应用于细菌及病毒的检测,它不仅能克服
PCR 扩增技术中难题,对 PCR
扩增技术还能起到补充作用。目前人们针对病毒,甚至 AIV
检测芯片不断优化杂交条件;将核酸扩增产物片段化,以减少核酸二、三级结构效应对杂交的影响;以及对芯片载体结构和检测方法进行改进,都为建立快速、灵敏、特异的
AIV 检测方法提供平台。

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以感染妊娠母猪晚期流产、产死胎、早产、木乃伊胎和弱胎,各种年龄猪(特别是仔猪)呼吸障碍、厌食为特征的高度传染性疾病,在美国最早发生该病。荷兰人Wensvoot等1991年首次于发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时被称为Lelystad病毒。随后很多国家也相继分离到此病毒。郭宝清等(1996)首次从国内有相似症状发病猪群中分离出猪繁殖与呼吸综合征病毒,从此代表该病在我国的存在。杨汉春阐述PRRSV有2个血清型,即美洲型(代表毒株为VR-2332株)和欧洲型(代表毒株为LV株),欧洲和美洲分离株毒株之间存在明显的抗原差异性。在对我国分离毒株的基因组进行分析表明,目前在我国流行的毒株均属于美洲型,并没有发现和分离到欧洲型毒株。汤德元等分析了美洲型的PRRSV,其可分为4个亚群,我国现今流行的PRRSV毒株属于四个亚群中的3个亚群,即以PRRSV
BJ-4株为代表的属于1亚群;以HB-1(sh)/2002、CH-la和HB-2(sh)/2002株为代表的属于2亚群;以BJ-13为代表的属于4亚群。本病传播迅速,尤其在养猪技术进步和经济发达国家,由于猪群密集、流转频繁,更易引起流行。目前,各国对本病进行了大量深入的研究。PRRS可危害各种日龄阶段的猪,并且临床表现多样,同时引起细菌病或病毒病等继发感染,导致临床症状的复杂化。因此,仅根据临诊症状及流行病学特点很难做出诊断,此病的诊断必须借助于实验室诊断技术。本文主要对近年来实验室对猪繁殖与呼吸综合征诊断方法的进展进行综述,以期为猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供一定的理论支持和参考。1
病毒的分离鉴定

核心提示:PCR技术自1985年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,表明其具有强大的生命力.近些年来,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创PCR技术自1985年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,表明其具有强大的生命力.近些年来,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维,对PCR技术进行研究和改进,使PCR技术得到了进上步地完善,并在此基础上派生出了许多新的用途.

病毒的分离鉴定是目前病毒病最真实的一种诊断方法。常用于PRRSV分离的细胞主要有猪肺泡巨噬细胞(PAMS)、非洲绿猴肾细胞(MA-104、CL-2621、Marc-145等),以及克隆自Marc-145的更敏感的HS.2H细胞。但分离PRRSV欧洲株只能用PAM细胞。该病毒的分离可来源于血清、肺脏、肺泡灌出物、脾脏、淋巴结和扁桃体,尤其以血清和肺脏组织分离成功率最高;较易从急性感染病例猪中分离到PRRSV;据有关报道PRRSV在死胎和新生仔猪中分布情况不一致,流产在死胎脾脏和淋巴结巨噬细胞分布含量比较多,而新生仔猪则常见于肺脏。采集后的样品应冷藏或冷冻运输和保存,将采集的样品经过处理后接种于长满的单层PAMs细胞后1~4
d即可出现细胞病变(CPE),细胞最初呈现灶状变圆、膨大,随后皱缩,脱落形成拉网空洞。当接种于CL-2621细胞时,CPE出现得比较缓慢,需在感染后2~6
d才会侵染细胞单层。PRRSV在接种于Marc-145细胞48
h即可出现典型的CPE变化,具高度敏感性。由于致病力的不同,不同分离株在细胞培养上生长情况各异,甚至有些病毒株并不出现CPE现象,与此同时,必须同时结合间接免疫荧光试验(IFA)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)等病原检测方法进行验证。

原位PCR技术

2 血清学诊断方法

原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术.

血清学试验是一种相对较于传统的PRRSV诊断方法,在病毒抗原和抗体的检测用得比较广泛。血清学实验有其较强的特异性,但在敏感性上有所欠缺。

原位PCR是Hasse等于1990年建立的,实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等.其基本方法为①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上,并用多聚甲醛处理,再灭活除去细胞内源性过氧化物酶.②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后,96℃2min以灭活蛋白酶K.③PCR扩增:在组织细胞片上,加PCR反应液,覆盖并加液体石蜡后,直接放在扩增仪的金属板上,进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置.④杂交:PCR扩增结束后,用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交.⑤显微镜观察结果.

2.1 中和试验

原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值.其特异性和敏感性高于一般的PCR.

在对PRRSV抗体进行检测的过程,中和试验(SN)对PRRSV的抗体特异性是很好的,但是由于中和抗体出现的时期比较晚,需在感染后4~5周才能首次检测到VN抗体,感染后的10周达到最高,在大部分的临床检测PRRSV新近病例中,与IPMA、IFA、ELISA作比较其敏感都低于它们,所以SN不适用于对PRRSV感染的早期诊断。Yoon等对中和试验进行了改良,其改良内容是加入20%的猪新鲜血清增加补体的量,目的是为了提高检测敏感性,在感染后9~11d即可检出较高滴度的VN抗体。但该方法也对环境、人员的技术要求高,目前也大多局限在实验室做研究用。

连接酶链反应

2.2 酶联免疫吸附试验

连接酶链反应,是一种新的DNA体外扩增和检测技术,主要用于点突变的研究及靶基因的扩增.

Albina等将PRRSV接种在PAM细胞上,以制备阳性抗原和模拟抗原,首次建立了检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),许多结果表明ELISA具有与IPMA一样的特异性,并且敏感性更高,如今商品化的间接ELISA诊断试剂已在全球范围内广泛使用。罗长保等将ATCCVR-2332株接种Hs.2H细胞,制备抗原,以血清抗体与模拟抗原反应的d450nm值作为标准,从而建立了用于血清中PRRSV抗体的间接ELISA方法,实验结果显示,有着与IFA相同的特异性,更高敏感性。王刚等用差速离心法提纯抗原,以NC膜做载体,成功地建立了Dot-ELISA,并与IFA具有相同的特异性,敏感性高于IFA。仝利剑等建立抗体双抗原夹心ELISA方法,利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对该方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区多个养猪场的近300份血清,总体的特异性和敏感性都较高。就目前看来,ELISA方法快速灵敏,特异性和敏感度均较高,操作简便,结果能自动显示,对于大批量血清样品的检测也实用。

连接酶链反应是Backman1997年为检出靶基因序列中的点突变而设计发明,并申报了专利.1988年Landegren也进行了该项研究.1988年Backman等又因分离热稳定的连接酶,而申报专利,1991年Backman和Barany分别用耐热DNA连接酶进行了LCR试验.耐热DNA连接酶可以在热循环中保持活性,提高连接反应的特异性,排除了背景扩增和免除了不断补充酶的繁琐程序.

2.3 间接荧光抗体试验

LCR的基本原理为利用DNA连接酶.特异地将双链DNA片段连接,经变性-退火-连接三步骤反复循环,从而使靶基因序列大量扩增.其程序为:在模DNA、DNA连接酶、寡核苷酸引物以及相应的反应条件下,首先加热至一定温度下使DNA变性,双链打开,然后降温退火,引物与之互补的模板DNA结合并留下一缺口,如果与靶序列杂交的相邻的寡核苷酸引物与靶序列完全互补,DNA连接酶即可连接封闭这一缺口,则LCR反应的三步骤就能反复进行,每次连接反应的产物又可在下一轮反应中作模板,使更多的寡核苷酸被连接与扩增.若连接处的靶序列有点突变,引物不能与靶序列精确结合,缺口附近核苷酸的空间结构发生变化,连接反应不能进行,也就不能形成连接产物.

间接荧光抗体试验与免疫过氧化物酶单层试验具有一样的特异、敏感性,如今在欧洲和北美的许多国家得到了普遍的使用。在我国也有自己生产的IFA和微量IFA诊断试剂盒供应。可以从感染6d后的猪体内检测到PRRSV抗体,在30~50d时抗体达到峰值,随后逐渐降低,直至4~6个月后抗体消失,但该方法需要进行细胞培养,需用倒置显微镜观察,结果不能自动显示,对所需环境和人员的要求高,不适合大规模监测;并且,IFA与IPMA只能检测出与实验用PRRSV抗原性相近的PRRSV分离株。

LCR的引物是两对分别互补的引物,引物长度为20~26个,以保证引物与靶序列的特异性结合,LCR识别点突变的特异性高于PCR,其特异性首先取决于引物与模板的特异性结合,其次是耐热连接酶的特异性.LCR连接反应温度接近寡苷酸的解链温度,因而识别单核苷酸错配的特异性极高.

2.4 免疫过氧化物酶单层试验

LCR的扩增效率与PCR相当,用耐热连接酶做LCR只用两个温度循环,94℃min变性和65℃复性并连接,循环30次左右.其产物的检测也较方便灵敏.目前该方法主要用点突变的研究与检测、微生物病原体的检测及定向诱变等,还可用于单碱基遗传病多态性及单碱基遗传病的产物诊断,微生物的种型鉴定,癌基因的点突变研究等.

免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)方法是历史最长的检测PRRSV抗体的方法,在欧洲国家被普遍使用,IPMA具有较高的敏感性和特异性,能在病毒感染6
d后猪体中检出PRRSV抗体,该方法是基于PAMs、Cl-2621、Marc-145等细胞系上进行完成的,不好的是由于母猪血清和4周龄内的仔猪血清可以与对照的巨噬细胞反应,导致背景着色,从而影响结果的判定,且结果不能自动显示,具一定的主观性;同时还需细胞培养和倒置显微镜观察,费力费时,大规模检测费高,也不利于推广应用。

依赖核酸序列的扩增

2.5 乳胶凝集试验(LAT)

依赖核酸序列的扩增,又称自主序列复制系统或再生长序列复制技术.1990年Guatelli等首先报道了这一技术.NASBA主要用于RNA的扩增、检测及测序.该反应有赖于AMV逆转录酶,T7RNA多聚酶和核酸酶H共同协作而完成.

王忠田等利用纯化的PRRSV重组M蛋白致毒乳胶制成乳胶抗原,成功地将LAT用于PRRSV血清抗体的检测,具有良好的特异性。用LAT与IDEXX公司抗体检测试剂盒同时对76份猪血清样本进行检测,结果表明LAT的特异性和敏感性均为95%,与IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒的总符合率为87%,检出率基本一致。因LAT具有操作简便、快速、敏感性高、特异性强、价格低廉且可用于现场检测等优点,是一种适合基层检测PRRSV血清抗体的新方法。

NASBA反应体系中除含有上述三种酶外,还含有dNTP,NTP,两种特殊的引物和缓冲液.引物I3’末端与靶序列互补,5’端含T7RNA多聚酶的启动子,这一引物是用于合成cDNA的.引物Ⅱ的碱基序列与cDNA的5’未端互补.

2.6 胶体金抗体检测技术

在NASBA反应时,首先引物Ⅰ与RNA模板复性,AMV逆转录酶催化合成cDNA,RNaseH水解cDNA上的RNA,形成一条单链的DNA;引物Ⅱ随即与此cDNA的5’未端结合,逆转录酶在此DNA模板的指导下合成第二条DNA链.这样形成的DNA双链含有T7RNA多聚酶的启动子.该酶即以此DNA为模板,转录出与样品RNA序列相同的RNA链,而且每条DNA模板在该酶的作用下可合成约100个拷贝的RNA.每条新的RNA又可作为逆录酶的模板合成cDNA.如此反复进行,将获得更多的RNA和cDNA.

崔尚金等建立猪繁殖与呼吸综合征胶体金抗体检测技术,运用胶体金标记纯化后的PRRSV基因工程表达抗原,以一种微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV抗体的胶体金免疫层析法(GICA)。特异性交叉试验证明,GICA检测PRRSV抗体有较高的特异性,与其他方法对比检测证实了其敏感性,生产了一批免疫胶体金试纸条,检测36份临床样本,其中30份经免疫胶体金试纸条及ELISA、免疫荧光检测均为阳性。猪繁殖与呼吸综合征免疫胶体金抗体检测技术的建立为检测PRRSV抗体提供了一种快速简便的方法。当然,目前国内一些大专院校也建立了更为方便、快速的诊断方法,如乳胶凝集试验和间接血凝试验,但其在敏感性、特异性和试剂的重复性、稳定性上均有待提高。

其基本方法为:将引物,标本加入扩增反应液,65℃1min使RNA分子二级结构打开,降温至37℃加入逆转录酶,T7RNA聚合酶和RNaseH,并在37℃反应1~1.5小时,其产物经琼脂糖电泳,溴乙锭染色即可在紫外仪下看到条带.NASBA的特点为操作简便,不需特殊仪器,不需温度循环.整个反应过程由三种酶控制,循环次数少,忠实性高,其扩增效率高于PCR,特异性好.

3 PRRSV的分子生物学诊断

转录依赖的扩增系统

3.1 RT-PCR检测

转录依赖的扩增系统,是Kwen等人于1989年研究报道的,主要用于扩增RNA.

PRRSV的RT-PCR检测在许多研究及检测诊断实验室已普遍使用,且敏感度达到了pg水平。Suarez等建立了检测PRRSV的RT-PCR方法,该方法敏感性好,并可检出隐性感染。Mar-Dassi等通过设计特异性的上下游通用引物,建立了鉴别诊断北美加拿大株和欧洲株PRRSV的RT-PCR诊断方法,该方法在组织中检测时敏感性高于IFA敏感性。赵耘等建立的检测PRRSV的套式RT-PCR法,其敏感性与RT-PCR法相同,且操作更简单。顾海洋等根据猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病在NSP2基因上有87bp连续缺失,从NCBI上下载7对猪高致病性蓝耳病保守序列设计一对引物。通过RT-PCR方法进行检测证明实验室所保存的这两株毒株分别为猪高致病性蓝耳病和低致病性蓝耳病,并且建立了猪高致病性蓝耳病与低致病性蓝耳病的检测方法。

合成A、B引物,引物A的3’末端与待扩增RNA互补,其5’端有T7RNA多聚酶的启动子信息.逆转录酶以A引物为起点合成cDNA;引物B与此cDNA3’端互补合成cDNA第二链.逆转录酶除具有逆转录活性外,还有DNA多聚酶的活性及RNaseH的活性.T7RNA多聚酶又以此双链DNA为模板.转录出与待扩增RNA一样的RNA,这些RNA又可作为下轮反应的模板.T7RNA多聚酶的催化效率很高,一个模板可转录10~103个RNA拷贝,因而反应液中待检RNA的数量以10的指数方式扩增.

3.2 实时荧光定量PCR

TAS的主要特点是扩增效率高,因为其RNA拷贝数呈10的指数方式增加,只需6个循环靶序列的拷贝数就能达到2×106.它的另一个特点是特异性高,由于TAS只能进行6次温度循环,错掺率低,加之用葡聚糖珠夹心杂交,因而特异性也高.虽然本法有较高的特异性和敏感性,但其循环过程复杂,需重复加入逆转录酶和T7RNA多聚酶,有待进一步研究.

在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术可定量PCR。实时荧光定量PCR技术(real
time fluorescent quantitativePCR,FQ-PCR)于1996年由美国Applied
Biosystems公司推出,它的原理是在PCR反应体系中添加合适的荧光基团,利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程,随后利用标准曲线对未知目的片段进行定量分析的手段。该方法不仅实现了对DNA模板的定量,并且具有高灵敏度、特异性和可靠性更强、自动化程度高、实时性和准确性等特点,如今已普遍用于分子生物学研究和医学研究等各类领域。

Qβ复制酶反应

在外国,实时荧光定量PCR技术在动物疫病的临床诊断方面应用也十分广泛。Callahan等(2006)建立的real-time
RT-PCR技术可以用于检测猪精液、血清及各类组织中的PRRSV,省时省力且敏感度高于常规RT-PCR。Martinez等优化改良了的PRRSV
SYBR Green
I时RT-PCR检测方法,具有很高的特异性和敏感性,其检出量为101.52TCID50/样品,并通过TM值和溶曲线分析基因型,能够很好地鉴别美洲株和欧洲株PRRSV毒株的基因型。

Kacian等于1972年首次报报Qβ复制酶催化RNA模板的自我复制功能,它能在常温30min,将其天然模模MDV-1RNA扩增至109.1986年Chu等报道用生物标记的靶序列特异性探针,可与亲和素联接的MDV-1RNA杂交,经洗脱未被结合的MDV-1后,再加入Qβ复制酶,扩增复制MDV-1拷贝,然后用溴乙锭染色检测或用同源性的第二探针杂交.

王宗照等根据Genbank中的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)基因组序列设计1对特异性引物,建立了基于SYBR
Green
I实时PCR检测HP-PRRSV的方法。结果表明,该方法能够检测到HP-PRRSV的存在,不与其他猪源病毒发生非特异性反应。与常规PCR方法相比,两者的符合率为100%。该方法具有快速、简便、敏感等优点。王荣等根据Genbank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M基因序列设计1对特异性保守引物,扩增位置在M基因的14744-14846位,长度为103
bp。提取PRRSV的RNA,并反转录成cDNA,以此cDNA为模板建立了SYBRGreen
I实时定量PCR检测PRRSV的方法。并用该方法检测送检的临床疑似病料,试验结果表明,本研究建立的PRRSVSYBR
Green I
PCR特异性强,耗时短,操作简单。刘长龙等为快速检测PRRSV,针对其N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并改良检测PRRSV的Taq
MAN荧光定量PCR方法。应用该方法检测除猪繁殖与呼吸综合征病毒以外的猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的测试敏感度可达到10拷贝,比普通PCR灵敏10~100倍,结果表明该实验建立的PRRSV
Taq Man荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。

Qβ复制酶是一种RNA指导的RNA聚合酶,它有3个特点:①不需寡核苷酸引物的引导就可启动RNA的合成.②能特异地识别RNA基因中由于分子内碱基配对而形成的特有的RNA折叠结构.③在Qβ复制酶的天然模板MDV-1RNA的非折叠结构区插入一短的核酸序列不影响该酶的复制.因而,如在此区插入核酸探针,则其序列照样可能被Qβ复制酶扩增.

3.3 依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)

1988年Lizardi等,将靶基因序列插进MDV-1质粒里,用T7RNA聚合酶催化转录出MDV-1RNA探针,这种RNA探针可与靶序列杂交,然后洗去非杂交的探针,加入Qβ复制酶来扩增探针,被扩增的探针又可作为模板进行扩增,并呈指数递增.其产物按上述两种方法进行检测.现在该技术又发展了夹心杂交法,分子开关和靶依赖的复制等技术.

NASBA即依赖于核酸序列的扩增,是一种扩增RNA的新技术,是由1对引物引导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42
℃进行,可在2h左右将模板RNA扩增约109倍,不需特殊的仪器。梁海霞等针对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF1中编码nsp2的基因序列设计引物,创建了NASBA方法,并联合微孔板中液相杂交与酶标显色反应检测NASBA扩增产物,建立了检测高致病性PRRSV的NASBA-ELISA。琼脂糖凝胶电泳表明,NASBA方法扩增出了特异性核酸阳性条带。将NASBA产物RNA系列稀释后同时进行了ELISA和Northern杂交。结果显示,ELISA和Northern杂交最高可分别检测到1:50和1:30稀释的产物RNA。采用建立的NASBA-ELISA可检测到101.83TCID50/Ml的Hun4株PRRSV。该方法只对3株高致病性PRRSV的检测结果为阳性,对经典株PRRSV和其他猪源病毒的检测结果均为阴性。结果表明,NASBA-ELISA能够敏感并特异地检测高致病性PRRSV,预示NASBA在PRRSV检测上应用前景广阔。

标记PCR和彩色PCR

3.4 原位杂交技术(ISH)

标记PCR,LP-PCR是利同位素或荧光素对PCR引物的5’端进行标记,用来检测靶基因是否存在.彩色PCR,是LP-PCR的一种.它用不同颜色的荧光染料;标记引物的5’端,因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5’的染料,通过电泳或离心沉淀,肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况,此法可用来检测基因的突变,染色体重排或转位,基因缺失及微生物的型别鉴定等.

Suarez等以PRRSVRNA为模板,通过RT-PCR扩增和地高辛标记,制备了ORF7433bP
cDNA地高辛探针,对试验感染猪的肺脏、淋巴结和肾脏进行了原位杂交,检测到了PRRSVRNA,较免疫组化具有更高的敏感性和特异性。Chueh等通过制备地高辛探针,成功建立了敏感荧光原位杂交技术,该方法采用原位RNA/RNA杂合体与抗地高辛抗体碱性磷酸酶结合,再用坚固红TR盐/萘酚As-MX磷酸盐显色,用显微镜观察,并认为该方法结果明显、清晰,对PRRS临床诊断及病毒持续感染研究有重要意义。

反向PCR

3.5 环介导等温扩增技术

反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切,然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行PCR,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究.

Notomi等开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法,即环介导等温扩增法(Loop-Mediated
Isothermal
Amplification,LAMP),其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。张跃伟等建立了荧光显色在环介导等温扩增(LAMP)检测PRRSV的方法,该方法使用了针对靶序列M+N基因的1组引物,并且能在63
℃等温条件下30
min内完成反应。在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒。结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可快速检测PRRSV。鑫婷等建立了PRRSV
RT-LAMP检测方法,试验结果表明,RT-LAMP检测方法可快速、灵敏、特异的检测PRRSV,并适用基层和现场检测,其他人Rovira等、Chen等也建立了类似的方法。LAMP是一种崭新的DNA扩增方法,具有简单、快速、特异性强的特点,具有替代PCR方法的可能性。

不对称PCR

3.6 基因芯片检测技术

不对称PCR是用不等量的一对引物,PCR扩增后产生大量的单链DNA.这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50~100∶1.在PCR反应的最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物消耗完后,非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量,需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增,制备双键DNA,,然后以此dsDNA为模板,再以其中的一条引物进行第二次PCR,制备ssDNA.不对称PCR制备的ssDNA,主要用于核酸序列测定.

杨林等建立PRRSV基因芯片检测技术,其根据PRRSV的核衣壳蛋白编码基因序列设计了1对特异性引物P1/P2,扩增出大小为294
bp的目的条带;再根据目的片段,设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5端用荧光素CY3标记。以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对PRRSV的检测,建立PRRSV的基因芯片检测方法。利用该方法对39份猪组织样品进行检测,表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,对PRRSV的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。郭焕成等建立高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒nsp2缺失变异株与经典美洲型毒株基因芯片鉴别方法,设计扩增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失区域的nsp2基因片段的二重PCR引物,并设计长度为31~35
bp的美洲型毒株通用寡核苷酸探针和非缺失株相对于变异株nsp2基因缺失区域的探针,建立寡核苷酸芯片方法。检测了该方法的特异性和灵敏度,并进行初步应用。结果通过杂交模式可清楚地区分经典毒株与缺失毒株;芯片探针与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒样品无非特异性杂交;芯片法与常规PCR法的灵敏度相近;对12份疑似高致病性PRRS猪样品的结果与普通PCR法一致。

重组PCR

由于当前PRRS给世界各国生猪养殖带来了巨大的经济损失,严重威胁了生猪养殖的发展,采用高效、特异、准确的检测技术对
PRRS进行诊断和控制有着重要的意义。而用于
PRRS检测的技术有多种多样,每一种检测方法均有其自身的优点与不足,现实的生产实践应用中应根据实际检测需要及实验条件等情况来选择相应的检测技术,从而为该病的诊断和防控措施的制订提供一定的依据。本文较详细地综述了目前常用的PRRSV的诊断方法与技术,不同的技术方法从不同方面对猪繁殖与呼吸综合征的诊断与防控提供了便利工具,大大加快了该病的防控步伐。随着相关研究在不断深入,许多新的诊断技术和方法还会不断涌现,这些都必将为今后的生猪养殖产业的发展带来更好的技术保障。

使两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR.Mullis等于1986年报道了由PCR扩增的两个DNA片段通过重组合后再经延伸而制备出新的DNA分子.其基本原理为将突变碱基,插入或缺失片段,或一种物质的几个基因片段均设计在引物中,先分段对模板扩增,除去多余的引物后,将产物混合,再用一对引物对其进行PCR扩增.其产物将是一重组合的DNA.重组PCR主要用于位点专一碱基置换,DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接.

多重PCR

一般PCR仅应用一对引物,通过PCR扩增产生一个核酸片段,主要用于单一致病因子等的鉴定.多重PCR,又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同.

多重PCR的用途主要有两方面:

1.多种病原微生物的同时检测或鉴定,它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物,进行PCR扩增.可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染,,可系统组合的有:①肝炎病毒的感染,在同一病人或同一供血者体内,有时存在多种肝炎病毒重叠感染,有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠;有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠;有时是乙丙型肝炎病毒重叠.②肠道致病性细菌的检测,如伤寒,痢疾和霍乱,有时具有较相同的肠道症状,有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病.③性病的检测,如梅毒,淋病及艾滋病的诊断.④战伤细菌及生物战剂细菌的检测,如破伤风杆菌,产气荚膜杆菌,炭疽杆菌,鼠疫杆菌等侦检.⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌,如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等.

2,病原微生物,某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原微生物,某些遗传病或癌基因,型别较多,或突变或缺失存在多个好发部位,多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有:乙型肝炎病毒的分型;乳头瘤病毒的分型;单纯疱疹病毒的分型;杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等.

多重PCR的特点有:①高效性,在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物,或对有多个型别的目的基因进行分型,特别是用一滴血就可检测多种病原体.②系统性,多重PCR很适宜于成组病原体的检测,如肝炎病毒,肠道致病性细菌,性病,无芽胞厌氧菌,战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检.③经济简便性,多种病原体在同一反应管内同时检出,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息.

免疫-PCR

免疫-PCR是新近建立的一种灵敏、特异的抗原检测系统.它利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原,尤其适用于极微量抗原的检测.

免疫-PCR试验的主要步骤有三个:①抗原-抗体反应,②与嵌合连接分子结合,③PCR扩增嵌合连接分子中的DNA.该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备.在免疫-PCR中,嵌合连接分子起着桥梁作用,它有两个结合位点,一个与抗原抗体复合物中的抗体结合,一个与质粒DNA结合,其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似,不同之处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA,在操作反应中形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物,通过PCR扩增DNA来判断是否存在特异性抗原.

免疫PCR优点为:①特异性较强,因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上.②敏感度高,PCR具有惊人的扩增能力,免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上,可用于单个抗原的检测.③操作简便,PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多,一般实验室均能进行.

生技网(www.biogo.net)

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

相关文章

网站地图xml地图